MÔI TRƯỜNG NA & NB - Copy

25

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

26

2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Escherichia coli do Phòng Thí Nghiệm Chuyển hóa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp. 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị Erlen 100 – 250 – 500 ml Ống nghiệm Que cấy vòng, que trải, đèn cồn Pipetman 10-100 và 100-1000µl kèm đầu típ vô trùng tương ứng Tủ cấy (Sanyo MCV711ATS - Japan) Cân phân tích (Sartorius - Germany) Máy đo pH (Eutech 510 - USA) Nồi hấp vô trùng (Hirayama HV110 - Japan) Máy siêu âm (Branson 1510 - USA) Máy ly tâm (Rotina 38 - Germany) Máy lắc (FGL 3006- Germany) Máy UV-Vis (Cary100 - Australia) Máy chụp TEM (JEM 1400 - Japan) Máy XRD (D8 Advance – Germany) 2.1.3 Hóa chất: Các hóa chất pha môi trường: cao thịt, pepton, NaCl, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4 (China, 99%) Nước cất vô trùng (Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano) AgNO3 (Merck- Germany, 99%) - Môi trường lỏng đặc trưng Bacillus [MT1] Peptone

5g

Cao thịt

3g

27

NaCl

3g

MgSO4.7H2O

0,2g

CaCl2.2H2O

0,15g

MnSO4.H2O

0,05g

Nước cất

vừa đủ 1000ml

pH = 6,8 ± 0,2 - Môi trường Nutrient Broth [MT2] (HiMedia – India) Cao thịt

1,5g

Cao nấm men

1,5g

Pepton

5g

NaCl

5g

Nước cất

vừa đủ 1000ml

pH = 7,4 ± 0,2

- Môi trường Nutrient Agar [MT3] (HiMedia – India) Cao thịt

1,5g

Cao nấm men

1,5g

Pepton

5g

NaCl

5g

Agar

15g

Nước cất

vừa đủ 1000ml

pH = 7,4 ± 0,2

28

2.2 Phương pháp tiến hành 2.2.1. Khảo sát khả năng tăng trưởng của B.subtilis và B.licheniformis 2.2.1.1 Dựng đường tương quan tuyến tính giữa mật độ quang OD (độ đục) và mật độ vi khuẩn (CFU/ml) v Nguyên tắc: Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử có mặt trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mât độ tế bào và độ đục. Có thể dựng đường quan hệ tuyến tính giữa mât độ tế bào và độ đục (OD) bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác định theo các phương pháp như phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc... v Phương pháp tiến hành Dịch huyền phù vi khuẩn (B.subtilis, B.licheniformis) được pha loãng để có OD đạt các giá trị lân cận với 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5. Đo OD của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế. Với mỗi độ pha loãng lấy 100µl đem trải lên đĩa petri môi trường [MT3] để xác định mật độ tế bào tương ứng. Mật độ vi khuẩn trong dung dịch ban đầu ứng với một giá trị OD xác định được tính theo công thức sau:

Mi (CFU/ml) = Ai ×

Di V

(2.1)

Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình trong đĩa Di là độ pha loãng V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

29

Tính giá trị log (CFU/ml) tương ứng với mỗi giá trị OD. Vẽ đường biểu diễn của log (CFU/ml) (trục tung) theo OD của dung dịch (trục hoành). Dùng chương trình Excell 2007 để xác định phương trình tuyến tính giữa mật độ quang OD và mật độ vi khuẩn

Y = aX Trong đó X: OD của dung dịch Y: mật độ vi khuẩn trong dung dịch (CFU/ml) - Dùng phương trình tuyến tính thu được để tính mật độ vi khuẩn trong mẫu khi biết giá trị OD. 2.2.1.2 Dựng đường cong tăng trưởng : v Nguyên tắc: Tế bào vi sinh vật khi hiện diện trong môi trường sẽ cản ánh sáng tới làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Do vậy có thể xác định được mật độ tế bào vi khuẩn theo thời gian thông qua độ đục (OD) bằng máy so màu ở bước sóng thích hợp [8]. v Phương pháp tiến hành Nuôi vi khuẩn (B.subtilis, B.licheniformis) trong bình chứa 250 ml môi trường [MT1], cách một khoảng thời gian nhất định (1 giờ) tiến hành hút 5 ml huyền phù cho vào cuvette đo OD ở bước sóng 660nm. Cuvette đối chứng chứa môi trường không cấy vi sinh vật. Với mỗi trị số OD đo được, dựa vào phương trình tuyến tính và đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ, suy ra mật độ vi khuẩn tương ứng tại thời điểm đo. Nếu giá trị OD thu được vượt quá 0,5 (ngưỡng giá trị chính xác của máy đo) ta pha loãng sau đó đo giá trị OD dung dịch đã pha loãng, ghi nhận tỉ lệ pha loãng.

30

Từ giá trị mật độ vi khuẩn xác định được đồ thị mật độ tế bào log(CFU/ml) (trục Oy) theo thời gian nuôi cấy (giờ) (trục Ox). Một đồ thị đúng diễn tả được 4 pha tăng trưởng của vi sinh vật: pha tiềm tàng, pha tăng trường hàm mũ, pha ổn định và pha suy tàn. Từ đó xác định tốc độ tăng trưởng đặc trưng tối đa của vi khuẩn. Giá trị này chính là tốc độ tăng trưởng đặc trưng của vi khuẩn ở pha log và được xác định bằng công thức sau:

(2.2) Trong đó: µ: tốc độ tăng trưởng đặc trưng (1/h). X0, Xm: mật độ sinh khối ở đầu và cuối quá trình tăng trưởng. t: độ dài thời gian của quá trình tăng trưởng. 2.2.2. Khảo sát quá trình sinh tổng hợp nano bạc 2.2.2.1. Khảo sát hàm lượng sinh khối vi khuẩn thích hợp Chủng B.subtilis, B.licheniformis được nuôi cấy lắc trong môi trường [MT1] ở 37oC, 200rpm; Sau 24 giờ, dịch vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 3000 rpm, 15 phút; Loại bỏ dịch nổi, thu sinh khối và rửa với đệm phosphate pH 7,0; Chuyển lần lượt 3, 5, 10, 20g sinh khối vi khuẩn thu được vào các bình chứa 100ml dung dịch AgNO3 1mM; Tiến hành phản ứng trong tối, lắc với tốc độ 200rpm, ở 37oC trong 4 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm 5000 rpm trong 15 phút: • Đối với B.subtilis thu lấy dịch nổi sau ly tâm đem đo UV-Vis. • Đối với B.licheniformis thu sinh khối và rửa với dung dịch đệm phosphate pH7;

31

Huyền phù sinh khối trong 20ml đệm phosphate pH 7; Phá màng tế bào bằng sóng siêu âm trong vòng 30 giây (lặp lại 5 lần); Dịch sau khi xử lý đem ly tâm ở tốc độ 10000 rpm trong 30 phút; Thu lấy dịch nổi sau ly tâm đem phân tích. Tiến hành tương tự đối với mẫu đối chứng gồm: 10g sinh khối B.subtilis hoặc B.licheniformis và 100ml nước cất. Dựa vào kết quả phân tích phổ UV-Vis để xác định lượng sinh khối vi khuẩn phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp nano bạc. 2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc Chủng B.subtilis, B.licheniformis được nuôi cấy lắc trong môi trường [MT1] ở 37oC, 200rpm; Sau 24 giờ, dịch vi khuẩn được ly tâm tốc độ 3000 rpm, 15 phút; Thu sinh khối và rửa với đệm phosphate pH 7,0; Chuyển 10g sinh khối vào bình chứa 100ml dung dịch AgNO3 có nồng độ lần lượt là 0.5mM, 1mM, 2mM, 3mM; Tiến hành ủ trong tối và lắc với tốc độ 200rpm, ở 37oC trong 4 ngày; . Lấy 100 µl dịch nuôi cấy ở mỗi nồng độ đem pha loãng và trải trên môi trường Nutrient Agar [MT3]; Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Đếm số khuẩn lạc thu được, xác định được mật độ vi khuẩn sống sót ứng với các nồng độ AgNO3 khác nhau. Đồng thời dịch nuôi cấy cũng được ly tâm 5000 rpm trong 15 phút • Với B.subtilis thu lấy dịch nổi sau ly tâm đem đo UV-Vis. • Với B.licheniformis thu sinh khối, rửa sạch và huyền phù sinh khối trong 20ml đệm phosphate pH 7; Dùng sóng siêu âm phá màng tế bào vi khuẩn (5 chu kỳ, mỗi chu kỳ kéo dài 30 giây); Dịch đã xử lý với sóng siêu âm được ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 30 phút;

32

Thu lấy dịch nổi sau ly tâm đem phân tích UV-Vis. Tiến hành mẫu đối chứng tương tự như mục 2.2.2.1. Dựa vào kết quả phân tích phổ UV-Vis và mật độ vi khuẩn sống sót theo nồng độ AgNO3 để xác định nồng độ muối AgNO3 phù hợp cho quá trình tổng hợp. 2.2.2.3. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc Hai chủng B.subtilis và B.licheniformis được nhân sinh khối trong môi trường [MT1] ở 37oC, 200rpm trong 24 giờ; Dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 3000 rpm trong 15 phút; Thu sinh khối và rửa với dung dịch đệm phosphate pH 7; Chuyển 10g sinh khối vào 100ml dung dịch AgNO3 2mM và ủ trong tối ở 37oC, 200 rpm trong vòng từ 1 đến 6 ngày; Lần lượt thu lấy 15 ml dung dịch trên từ ngày 1 đến ngày thứ 6 và đem ly tâm ở 5000 rpm trong 15 phút; • Đối với B.subtilis thu lấy dịch nổi đem đo UV-Vis. • Đối với B.licheniformis thu sinh khối và rửa sạch với dung dịch đệm phosphate pH7; Cho vào máy siêu âm để phá màng tế bào (5 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30 giây); Sau đó đem ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 30 phút để loại mãnh vỡ tế bào; Thu lấy dịch nổi sau ly tâm đem phân tích UV-Vis. Tiến hành mẫu đối chứng tương tự như mục 2.2.2.1. Dựa vào kết quả phân tích phổ UV-Vis của các mẫu theo thời gian để xác định thời gian tổng hợp nano bạc thích hợp nhất.

33

2.2.3. Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) Tiến hành phản ứng sinh tổng hợp với: • 10g sinh khối B.subtilis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 4 ngày ly tâm 5000 rpm trong 15 phút thu dịch nổi. • 10g sinh khối B.licheniformis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 5 ngày ly tâm thu sinh khối, rửa sạch và huyền phù sinh khối trong 20ml đệm phosphate pH 7; Dùng sóng siêu âm phá màng tế bào vi khuẩn (5 chu kỳ, mỗi chu kỳ kéo dài 30 giây). Dịch đã xử lý với sóng siêu âm được ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 15 phút (2 lần), thu lấy dịch nổi sau ly tâm. Dịch nổi này được trải lên lame để khô và đem phân tích XRD để khẳng định sự hiện diện của hạt nano bạc. 2.2.4. Phân tích kích thước và hình dạng hạt nano bạc tạo thành (TEM) Thực hiện phản ứng sinh tổng hợp với 100ml dung dịch AgNO3 (2mM) và 10g sinh khối B.subtilis (trong 4 ngày), B.licheniformis (5 ngày). Sau đó xử lý mẫu và thu lấy dịch nổi giống như trong phần [2.2.3]. Dịch nổi thu được đem chụp TEM để xác định hình dạng và sự phân bố kích thước hạt nano bạc. 2.2.5. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc v Nguyên tắc Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia và tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Trong phương pháp này cần phải pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng sau khi đã nuôi cấy ở 37oC

34

trong 24-48 giờ [8]. Từ đó tính mật độ tế bào và hiệu suất kháng khuẩn theo công thức (2.1) và (2.3). v Phương pháp tiến hành Cho 1ml dung dịch nano bạc (thu được sau 2, 3, 4, 5, 6 ngày tiến hành sinh tổng hợp) vào ống nghiệm chứa 1ml dịch vi khuẩn E.coli trong môi trường Nutrient Broth [MT2]. Tiến hành mẫu đối chứng tương tự nhưng thay dung dịch chứa nano bạc bằng nước cất. Sau 15 phút dịch vi khuẩn từ ống thí nghiệm và ống đối chứng được đem pha loãng đến 10-2, 10-3, 10-4. Từ mỗi nồng độ pha loãng lấy ra 100µl đem trải lên đĩa môi trường Nutrient Agar [MT3]. Ủ ở 370C trong 24-48 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được. Cách tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa. Dùng những đĩa có số khuẩn lạc từ 25-300 (theo FDA) để tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu. Mật độ tế bào vi sinh vật được tính theo công thức sau [6]:

Mi (CFU/ml) = Ai ×

Di V

(2.1)

Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình trong đĩa Di là độ pha loãng V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Hiệu suất kháng khuẩn được xác định theo công thức sau:

η=

N1 – N2 N1

× 100%

Trong đó N1 là số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng N2 là số khuẩn lạc trong đĩa chứa nano bạc

(2.3)

35

2.2.6. Khảo sát độ bền của dung dịch nano bạc tạo thành Tiến hành phản ứng sinh tổng hợp với: • 10g sinh khối B.subtilis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 4 ngày ly tâm 5000 rpm trong 15 phút thu dịch nổi. • 10g sinh khối B.licheniformis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 5 ngày ly tâm thu sinh khối, rửa sạch và huyền phù sinh khối trong 20ml đệm phosphate pH 7, phá màng tế bào vi khuẩn bằng sóng siêu âm, đem ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 15 phút (2 lần), thu lấy dịch nổi sau ly tâm . Dịch nổi thu được đem đo UV-Vis sau đó tiếp tục bảo quản trong 3 tháng rồi đem đo lại UV-Vis. So sánh kết quả thu được giữa 2 lần đo. 2.2.7. Chế tạo vải kháng khuẩn non-woven Phương pháp ngâm tẩm được sử dụng để chế tạo vải non-woven kháng khuẩn. Qui trình chế tạo có thể được mô tả như sau: Mẫu vải được cắt với kích thước khoảng 9,5 × 17 cm sau đó được rửa sạch và sấy khô. Đem mẫu vải sau khi sơ chế ngâm vào trong dung dịch keo nano bạc tổng hợp được trong khoảng thời gian 2 giờ. Sau khi ngâm tẩm xong, mẫu vải được đem sấy khô và giặt lại cho các hạt nano bạc bám trên bề mặt tấm vải với lực liên kết yếu được thoát ra và loại bỏ phần dung dịch chưa bám lên vải. Các mẫu vải trước và sau khi ngâm tẩm được đem phân tích FE-SEM để đánh giá khả năng bám dính các hạt Ag trên nền vải non-woven. Đồng thời các mẫu vải sau khi ngâm được giặt qua 5, 10, 15 lần. Sau đó khảo sát khả năng kháng khuẩn dựa theo phương pháp đếm khuẩn lạc tương tự như trong phần [2.2.5].